PCR, är polymeraskedjereaktionen, som hänvisar till tillägget av dNTP, Mg2+, förlängningsfaktorer och amplifieringsförstärkningsfaktorer till systemet under katalys av DNA-polymeras, med användning av moder-DNA som mall och specifika primrar som utgångspunkt för förlängning, Genom stegen denaturering, hybridisering, förlängning, etc., kan processen att in vitro replikera dottersträngs-DNA som är komplementär till modersträngens mall-DNA snabbt och specifikt amplifiera vilket mål-DNA som helst in vitro.
1. Hot Start PCR
Starttiden för amplifiering i konventionell PCR är inte att sätta in PCR-maskinen i PCR-maskinen, och sedan börjar programmet att amplifiera.När systemkonfigurationen är klar börjar amplifieringen, vilket kan orsaka ospecifik förstärkning, och hot-start PCR kan lösa detta problem.
Vad är hot start PCR?Efter att reaktionssystemet har förberetts frisätts enzymmodifieraren vid hög temperatur (vanligtvis högre än 90°C) under det initiala uppvärmningssteget av reaktionen eller "hot start"-steget, så att DNA-polymeraset aktiveras.Den exakta aktiveringstiden och temperaturen beror på arten av DNA-polymeraset och varmstartsmodifieraren.Denna metod använder huvudsakligen modifierare som antikroppar, affinitetsligander eller kemiska modifierare för att hämma aktiviteten av DNA-polymeras.Eftersom aktiviteten av DNA-polymeras hämmas vid rumstemperatur, ger varmstartsteknologi stor bekvämlighet för att förbereda flera PCR-reaktionssystem vid rumstemperatur utan att offra specificiteten hos PCR-reaktioner.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transcription PCR) är en experimentell teknik för omvänd transkription från mRNA till cDNA och använda det som en mall för amplifiering.Den experimentella proceduren är att först extrahera totalt RNA i vävnader eller celler, använda Oligo (dT) som en primer, använda omvänt transkriptas för att syntetisera cDNA och sedan använda cDNA som en mall för PCR-amplifiering för att erhålla målgenen eller detektera genuttryck.
3. Fluorescerande kvantitativ PCR
Fluorescerande kvantitativ PCR (kvantitativ i realtid,RT-qPCR) hänvisar till metoden att lägga till fluorescerande grupper till PCR-reaktionssystemet, genom att använda ackumulering av fluorescerande signaler för att övervaka hela PCR-processen i realtid, och slutligen använda standardkurvan för att kvantitativt analysera mallen.Vanligt använda qPCR-metoder inkluderar SYBR Green I och TaqMan.
4. Kapslad PCR
Kapslad PCR hänvisar till användningen av två uppsättningar PCR-primrar för två omgångar av PCR-amplifiering, och amplifieringsprodukten från den andra omgången är målgenfragmentet.
Om en felaktig matchning av det första paret primrar (yttre primers) gör att en ospecifik produkt amplifieras, är möjligheten att samma ospecifika region igenkänns av det andra primerparet och fortsätter att amplifiera mycket liten, så amplifiering av det andra paret av primrar, har specificiteten för PCR förbättrats.En fördel med att utföra två omgångar av PCR är att det hjälper till att amplifiera tillräckligt med produkt från begränsat start-DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR är en metod för att förbättra specificiteten för PCR-reaktionen genom att justera PCR-cykelparametrarna.
I touchdown-PCR är glödgningstemperaturen för de första cyklerna inställd några grader över den maximala glödgningstemperaturen (Tm) för primrarna.Högre hybridiseringstemperatur kan effektivt minska ospecifik amplifiering, men samtidigt kommer högre hybridiseringstemperatur att förvärra separationen av primrar och målsekvenser, vilket resulterar i minskat PCR-utbyte.Därför, under de första cyklerna, är glödgningstemperaturen vanligtvis inställd på att minska med 1°C per cykel för att öka innehållet av målgenen i systemet.När glödgningstemperaturen sänks till den optimala temperaturen, bibehålls glödgningstemperaturen under de återstående cyklerna.
6. Direkt PCR
Direkt PCR avser amplifiering av mål-DNA direkt från provet utan behov av nukleinsyraisolering och rening.
Det finns två typer av direkt PCR:
direkt metod: ta en liten mängd prov och tillsätt det direkt till PCR Master Mix för PCR-identifiering;
krackningsmetod: efter provtagning av provet, tillsätt det till lysatet, lysera för att frigöra genomet, ta en liten mängd lyserad supernatant och tillsätt den till PCR Master Mix, utför PCR-identifiering.Detta tillvägagångssätt förenklar det experimentella arbetsflödet, minskar praktisk tid och undviker DNA-förlust under reningsstegen.
7. SOE PCR
Gensplitsning genom överlappande förlängning PCR (SOE PCR) använder primrar med komplementära ändar för att få PCR-produkter att bilda överlappande kedjor, så att i den efterföljande amplifieringsreaktionen, genom förlängningen av de överlappande kedjorna, olika källor till A-teknik där amplifierade fragment överlappas och skarvas ihop.Denna teknologi har för närvarande två huvudsakliga tillämpningsriktningar: konstruktion av fusionsgener;gen platsriktad mutation.
8. IPCR
Invers PCR (IPCR) använder omvända komplementära primrar för att amplifiera andra DNA-fragment än de två primrarna, och amplifierar okända sekvenser på båda sidor av ett känt DNA-fragment.
IPCR designades ursprungligen för att bestämma sekvensen av intilliggande okända regioner, och används mest för att studera genpromotorsekvenser;onkogena kromosomala omarrangemang, såsom genfusion, translokation och transposition;och viral genintegration, används också ofta nu. För platsriktad mutagenes, kopiera en plasmid med den önskade mutationen.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) är en teknik för absolut kvantifiering av nukleinsyramolekyler.
Det finns för närvarande tre metoder för kvantifiering av nukleinsyramolekyler.Fotometri är baserad på absorbansen av nukleinsyramolekyler;realtidsfluorescerande kvantitativ PCR (Real Time PCR) är baserad på Ct-värdet, och Ct-värdet hänvisar till cykelnumret som motsvarar det fluorescensvärde som kan detekteras;digital PCR är den senaste kvantitativa teknologin baserad på enmolekyl PCR-metod för att räkna nukleinsyrakvantifiering är en absolut kvantitativ metod.
Posttid: 2023-jun-13